Stanovení cirkulujících imunokomplexů (CIK) precipitací polyetylenglykolem (PEG)

Dosud proběhlé cykly SEKK na stanovení CIK precipitací polyetylenglykolem (PEK-IKEM test) ukázaly, že toto stanovení je v našich laboratořích prováděno velice nestandardně a výsledky získané jednotlivými laboratořemi jsou tudíž nesrovnatelné. Níže navržený referenční postup vychází z originální metodiky popsané Haškovou a kol. [1].
Princip stanovení spočívá v "selektivní" precipitaci rozpustných imunokomplexů antigen-protilátka v séru naředěném 30-krát v prostředí 3,75% polyetylenglykolu o m.v. 6000 v borátovém pufru (pH 8,4; 0,1 mol/l) při pokojové teplotě (cca 23°C). Za těchto podmínek zůstává více než 90% imunoglobulinů nevyvázaných v komplexech antigen-protilátka rozpuštěno a nesráží se. Množství precipitátu se měří turbidimetricky při 450 nm a vyjadřuje se v pracovních jednotkách vyjadřujících naměřenou absorbanci násobenou 1000-krát. Zatím nebyla připravena referenční komerčně dostupná standarda pro tuto metodu. Je si však zapotřebí uvědomit, že v sérech o patologickém složení (vysoké konc. imunoglobulinů, makroglobulinů a pod.) může dojít ke zkreslení při interpretaci nalezených hodnot, poněvadž za těchto podmínek dochází ke koprecipitací těchto proteinů nalézajících se ve zvýšených koncentracích spolu s imunokomplexy.

Nejčastější rozdíly zjištěné v systému SEKK v metodikách jednotlivých laboratoří byly:

• Různá vlnová délka měření. Velmi důležitá je také především u kolorimetrů šířka pásma, které jednotlivé používané filtry propouštějí a jejich propustnost (týká se prakticky všech fotometrů pro mikrotitrační destičky).
• Různá optická dráha měření (původní metodika byla prováděna ve zkumavkách a měření prováděno v klasických kyvetách s optickou dráhou 1,00 cm). Při použití mikrometody prováděné v mikrotitračních destičkách s plochým dnem záleží optická dráha na množství reakčního roztoku v jamce destičky a průměru jamky destičky. Např. při průměru jamky 6,2 mm a objemu reakční kapaliny v jamce 200 µl je optická dráha 6,62 mm. Velmi důležité jsou také optické parametry dna jamek destičky (měly by být u všech jamek destičky stejné). Ne všechny typy destiček všech výrobců jsou proto pro tato stanovení vhodné.
• Vazebná kapacita povrchu jamek mikrotitračních destiček pro proteiny u mikromodifikací metody. Měly by být používány destičky s malou sorbční kapacitou pro proteiny (např. POLYSORB NUNC nebo M29A DYNEX).
• Různý PEG. PEG 6000 je směs polymerů různé molekulové váhy, které mají v daném systému různé preciptační schopnosti. Proto se mohou v daném systému polyetylenglykoly různých výrobců, byť stejně označené, svými účinky lišit. Jako referenční je zatím navrhován Polyethylenglycol 6000 zur Syntese, cat.no. S20346642 fmy MERCK, který obsahuje PEG o stř.m.v. 5000-7000 a který zhruba odpovídá svými vlastnostmi PEG 6000 dodávánému dříve firmou Lachema. Ten používala většina laboratoří u nás.
• Různé konečné ředění séra, používané pufry, inkubační teplota atd.

Chceme-li proto pokročit ve standardizaci této metody, bude pro další kontrolní cykly SEKK velmi důležité, aby jednotlivé laboratoře ke svým výsledkům dodaly tyto údaje:

• Všechny změny, které oproti výše uvedené referenční metodě ve své modifikaci používají.
• U mikrometody typ a výrobce mikrotitrační destičky v níž je reakce a měření prováděno.
• Typ fotometru, na němž je měření prováděno a je-li optická dráha jiná než 1 cm, i délku optické dráhy. U kolorimetrů pokud možno i typ a parametry filtru.
• Teplotu měření.
• Zdroj polyetylenglykolu.
• Hodnotu hranice pozitivity (cut off) používanou v laboratoři a výsledky v tzv. indexovém hodnocení, t.j. index_vzorku = hodnota_{vzorku v arb.j.} / hodnota_{cut off v arb.j.}

Literatura:
1. Hašková V., Kašlík J., Mátl I., Matějíčková M.: Nový způsob stanovení cirkulujících imunokomplexů v lidských sérech. Čas.lék.čes. 116, 14, 1977, 436-437

Metodika bude dále popsána a zpracována tak, aby ji mohli případně v budoucnosti použít a přepsat uživatelé jednoduše do svých laboratorních příruček koncipovaných podle navrhovaného systému SLP.

Metodika

Název položky:	CIK
Interní kód:
Systém:	Sérum
Název pro nálezy:	CIK
Doporučený název:	CIK
Plný název:	cirkulující imunokomplexy
Synonymum názvu:
Procedura:	turbidimetrie
Druh veličiny:	arb.j.
Formát hodnoty:	Číslo na jedno desetinné místo
Běžný rozsah hodnot:	zatím individuálně pro jednotlivé laboratoře (orient. 5 až 100)
Odebírá se:	Krev
Množství:	cca 3 ml
Odběr do:	Sklo nebo plast bez úpravy
Dostupnost:	dle lokálních podmínek, většinou denně
Dostupnost rutinně:	adresa pracoviště, které metodu provádí
Dostupnost statimově:	dle lokálních podmínek, většinou není potřebné statimové vyšetření

Poznámka k odběru:
Sérum je nutno získat do cca 4 hod. po odběru a skladovat při 4 až 8°C, je-li zpracováno do 24 hod. po stažení, jinak zamražené při -20°C. Poněvadž zatím nebylo ověřené, zda zmražení séra nemění zvláště u některých patologických sér naměřené hodnoty, doporučuje se pro standardní postup všechna séra po stažení před dalším zpracováním zmrazit. Sérum nesmí být opakovaně rozmrazováno a zmrazováno. Pro stanovení se nehodí séra inaktivovaná (např. 30 min., 56°C pro KFR apod.), hemolytická, kontaminovaná nebo chylózní.

Jiné údaje:
Poněvadž zatím nejsou k dispozici komerční referenční séra, je nutné, aby si každá laboratoř připravila své interní kontroly, t.j. séra, kde určí hodnotu CIK, která pak zařazuje do každé série stanovení. Nejlépe je zařazovat kontroly dvě, jednu o nízké a druhou o vyšší hodnotě CIK. Tyto kontroly se uchovávají v malých podílech zmražené při -20°C a používají se vždy jen jednou!

 

Referenční meze:
typ	sex	věk od - do	referenční meze	jednotka	další údaje
N	musí být zatím defin. indiv. každou laboratoří			arb.j.

Abstrakt (princip):
Princip stanovení spočívá v "selektivní" precipitaci rozpustných imunokomplexů antigen-protilátka v séru naředěném 30-krát v prostředí 3,75% polyetylenglykolu o m.v. 6000 v borátovém pufru (pH 8,4; 0,1 mol/l) při pokojové teplotě (cca 23°C), zatímco více než 90% normálních sérových imunoglobulinů zůstává za těchto podmínek rozpuštěno. Množství precipitátu se měří turbidimetricky při 450 nm a vyjadřuje se v pracovních jednotkách vyjadřujících naměřenou absorbanci násobenou 1000-krát.

Pomocné postupy:

1. Pufry:

1,24% kyselina boritá (H₃BO₃, m.h. 61.83) .............. 6,82 g/550 ml dest. vody
1,9% borax (Na₂B₄O₇.10 H₂O, m.h. 381,37) ............ 8,55 g/450 ml dest. vody
tetraboritan disodný, dekahydrát

roztok A:

550 ml 1,24% kyseliny borité
450 ml 1,9% boraxu
1000 ml dest. vody

roztok B:

41,66 g PEG 6000
1000 ml roztoku A

Roztoky lze skladovat v lednici při 4 až 8°C minimálně 1 měsíc, pokud nedojde ke kontaminaci.

Vlastní pracovní postup:

1. Séra a pufry se nechají vytemperovat na pokojovou teplotu alespoň 1 hod.. Pokud byla séra skladována zmražená, po rozmražení se dobře zhomogenizují nejlépe na vortexu.
2. Připraví se pomocné ředění sér a kontrol tak, aby byly zředěné 3-krát (1 díl séra + 2 díly roztoku A) v pomocných zkumavkách.
   mikrometoda: 0,1 ml séra + 0,2 ml roztoku A
   makrometoda, 2 ml kyvety fotometru: 0,2 ml séra + 0,4 ml roztoku A
   makrometoda, 3 ml kyvety fotometru: 0,25 ml séra + 0,5 ml roztoku A
3. Připraví se reakční ředění sér a kontrol tak, aby jejich výsledné ředění bylo 30-krát, a to jednak v roztoku A (bez PEG), jednak v roztoku B (s PEG):
   makrometoda, 2 ml kyvety fotometru: 0,2 ml předředěného séra + 1,8 ml roztoku A, resp. roztoku B
   makrometoda, 3 ml kyvety fotometru: 0,3 ml předředěného séra + 2,7 ml roztoku A, resp. roztoku B
   mikrometoda: 0,020 ml předředěného séra + 0,180 ml roztoku A, resp. roztoku B.
   U mikrometody je vhodné provádět vyšetření v kvadruplikátech, nutné je však minimálně v duplikátech. Návrh uspořádání vzorků na mikrotitrační destičce je uveden níže.
   Zároveň se vzorky se připraví blank, který obsahuje roztok A v objemu 2 ml, resp. 3 ml u makrometod nebo 0,2 ml u mikrometody a kontrola roztoku B, který obsahuje tytéž objemy roztoku B.
4. Naředěné vzorky se dobře promíchají, u makrometody nejlépe na vortexu, u mikrometody na třepačce pro mikrotitrační destičky a inkubují 60 min. při pokojové teplotě. Pokud se tato teplota liší o více než ±2°C od 23°C, je zapotřebí vzorky inkubovat ve vodní lázni teplé 23°C.
5. Po inkubaci se vzorky opět dobře promíchají vortexem nebo na třepačce a změří absorbance (Abs) proti blanku.
6. Vypočtou se hodnoty CIK v arb.j. pro jednotlivé vzorky podle vzorce:
   hodnota CIK (arb.j.) = (Abs_{vzorku v roztoku B} - Abs_{vzorku v roztoku A}) * 1000
   U mikrometody se berou k výpočtu aritmetické průměry absorbancí jednotlivých hodnot. Pokud jsou vzorky stanovovány v kvadruplikátech, pak se ještě vyloučí případné odlehlé hodnoty pomocí Deanova a Dixonova nebo Grubsova testu. Jsou-li vzorky stanovovány v duplikátech, je zapotřebí zopakovat vyšetření u vzorků, u nichž se liší jednotlivé párové hodnoty absorbancí s absolutní hodnotou menší než 0,050 o více než 0,005 jednotek absorbance, u absorbancí větších než 0,050 o více než 10% průměrné hodnoty duplikátu. Vzhledem k standardizaci metody je zapotřebí hodnoty přepočítat na optickou dráhu 1 cm, tj. u mikrometdy násobit většinou hodnotou 1,5 (pro průměr jamky 6,2 mm a objem reakčního roztoku 0,200 ml).
7. Vypočtené hodnoty koncentrací CIK se vyhodnotí oproti hraniční (cut off) hodnotě, která je zatím udávána pro každou laboratoř individuální a tato laboratoř si ji určuje jako hodnotu aritmetického průměru zdravé populace + 2 směrodatné odchylky.

Interpretace výsledků

Touto metodou jsou stanovovány především "větší" imunokomplexy, které se vytvářejí v pozdějších stadiích imunitní reakce, která vede k jejich tvorbě. Měřitelný pokles zbytkové aktivity komplementového systému, měřený stanovením hemolytické aktivity komplementu, většinou předchází pozitivnímu zvýšenému nálezu CIK. Sledování dynamiky změn koncentrací CIK slouží k monitorování průběhu chorob jako jsou progr. arthritida, SLE, glomerulonefritida, pokročilá stadia nádorových onemocnění nebo rekonvalescence VHB. Je si však zapotřebí uvědomit, že v sérech o patologickém složení (vysoké konc. imunoglobulinů, makroglobulinů a pod.) může dojít ke zkreslení při interpretaci nalezených hodnot, poněvadž za těchto podmínek dochází ke koprecipitací těchto proteinů nalézajících se ve zvýšených koncentracích spolu s imunokomplexy. Pozitivní hodnoty mohou být také u cca 2% jedinců bez známek onemocnění.

Uspořádání vzorků na mikrotitrační destičce při stanovení CIK mikrometodou

- kvadruplikáty

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Blank

K1 A

K2 A

V1 A

V2 A

V3 A

V9 A

B

Blank

K1 A

K2 A

V1 A

V2 A

V3 A

V9 A

C

Blank

K1 A

K2 A

V1 A

V2 A

V3 A

V9 A

D

Blank

K1 A

K2 A

V1 A

V2 A

V3 A

V9 A

E

PEG

K1 B

K2 B

V1 B

V2 B

V3 B

V9 B

F

PEG

K1 B

K2 B

V1 B

V2 B

V3 B

V9 B

G

PEG

K1 B

K2 B

V1 B

V2 B

V3 B

V9 B

H

PEG

K1 B

K2 B

V1 B

V2 B

V3 B

V9 B

- duplikáty

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Blank

K2 A

V2 A

V20 A

B

Blank

K2 A

V2 A

V20 A

C

PEG

K2 B

V2 B

V20 B

D

PEG

K2 B

V2 B

V20 B

E

K1 A

V1 A

V3 A

V21 A

F

K1 A

V1 A

V3 A

V21 A

G

K1 B

V1 B

V3 B

V21 B

H

K1 B

V1 B

V3 B

V21 B

Blank = 200 µl roztoku A
PEG = 200 µl roztoku B
Kx A = kontrola v roztoku A
Kx B = kontrola v roztoku B
Vx A = vzorek v roztoku A
Vx B = vzorek v roztoku B