Laboratorní diagnostika ANCA - metodické doporučení SLI ČSAKI

Vyšetření protilátek proti cytoplazmě neutrofilů se v posledních několika letech stalo součástí základních panelů autoprotilátek v imunologických laboratořích. Zkušenosti získané z diskusí na odborných fórech a v systému externí kontroly kvality SEKK vedly k rozhodnutí připravit metodické doporučení správného laboratorního diagnostického postupu. Doporučení připravil výbor Sekce laboratorní imunologie ČSAKI pod autorským vedením dr. Lochmana. Za recenzi textu a cenné připomínky výbor SLI děkuje prof. Bartůňkové.

Protilátky proti cytoplasmě neutrofilů (Anti-Neutrophil Cytoplasmatic Antibodies) – ANCA - tvoří heterogenní skupinu protilátek, které se nacházejí u řady onemocnění a jsou namířeny proti antigenům cytoplasmy neutrofilů. Jejich tvorba souvisí zřejmě se zvýšeným výskytem antigenních struktur aktivovaných a rozpadajících se neutrofilů v místech zánětu, v němž neutrofily hrají významnou úlohu. Prvními metodami, které byly používány pro jejich detekci, byly metody nepřímé imunofluorescence (Indirect ImmunoFluorescence – IIF). V těchto metodách, kde jako substrát slouží různým způsobem fixované lidské granulocyty, vytvářejí tyto protilátky v zásadě dva typy fluorescence – zrnitou cytoplazmatickou nebo perinukleární (viz tab.1). Na základě typu této fluorescence lze dělit nález ANCA protilátek detekovaných IIF metodami na C-ANCA (cytoplasmatic ANCA) a P-ANCA (perinuclear ANCA).

Postupně byla izolována z cytoplasmy neutrofilů (zejména z primárních granul) řada antigenů, proti kterým se mohou tvořit protilátky způsobující cytoplazmatickou fluorescenci. Pro detekci a stanovení koncentrace protilátek proti některým z těchto antigenů byly vypracovány příslušné ELISA testy. Dodnes však ještě nebyly detekovány všechny antigeny, které mohou vyvolávat tvorbu autoprotilátek způsobujících na granulocytech ANCA fluorescenci, a tak v IIF metodách mohou být prokazovány ANCA protilátky, které nelze zatím detekovat pomocí ELISA, i když takové případy nejsou časté. Jak bylo zmíněno, typ IIF fluorescence závisí velmi na způsobu fixace neutrofilů a jejich kvalitě. Stejným postupem fixované neutrofily dodávané různými výrobci mohou poskytovat rozdílný obraz fluorescence a i přiřazení typu fluorescence k jednotlivým ANCA antigenům by mělo být prováděno velmi opatrně a jen s určitou pravděpodobností.

Komplikované je zejména přiřazování a hodnocení P-ANCA obrazu nalézaného na etanolem-fixovaných granulocytech. Tento typ fluorescence mohou vykazovat také některé protilátky proti jaderným antigenům - ANA, které mohou být prokazatelné i na běžných substrátech používaných pro detekci ANA. ANA protilátky specifické pro buňky myeloidní řady jsou označovány jako NANA (neutrophil associated nuclear antibodies) nebo GS-ANA (granulocyte-specific anti-nuclear antibodies) a vyskytují se velmi často u zánětlivých onemocnění gastrointestinální soustavy. Před vyslovením závěru, že se jedná o nález P-ANCA protilátek, je zapotřebí tento nález proto konfirmovat ještě na dalších substrátech (viz tab.1).

Nejdůležitější a nejvíce přínosná je detekce ANCA protilátek při podezření na akutní vaskulitidu malých cév s renálním selháním nebo závažným plicním postižením, kdy je toto vyšetření zapotřebí provádět jako statimová. Nejčastějšími cílovými antigeny u vaskulitid malých cév bývají proteináza 3 (PR3) u Wegenerovy granulomatózy, která poskytuje většinou hrubou až chuchvalcovitou C-ANCA fluorescenci jak na etanolem, tak na formolem fixovaných granulocytech a myeloperoxidáza (MPO), která poskytuje na etanolem fixovaných granulocytech většinou P-ANCA až ANA fluorescenci, většinou s prosvětlenými středy jader. Na formolem-fixovaných granulocytech tyto protilátky vykazují fluorescenci typu C-ANCA fluorescenci. MPO-ANCA se vyskytují nejčastěji u mikroskopické polyangiitidy. Zatímco specifita a senzitivita PR3-ANCA pro diagnózu Wegenerovy granulomatózy je kolem 95%, je jak specifita tak senzitivita MPO-ANCA pro diagnózu mikroskopické polyangiitidy mnohem nižší a MPO-ANCA se vyskytují i u celé řady dalších chorob. Proto je třeba hodnotit nález MPO-ANCA opatrněji a korelovat vždy s klinickým stavem pacienta.

Doporučení pro laboratorní postup:

Jako screening používat IIF detekci na etanolem fixovaných granulocytech. V případě P-ANCA nebo ANA fluorescence lze u takto provedeného screeningu pouze konstatovat, že na etanolem fixovaných granulocytech byla nalezena fluorescence
P-ANCA/ANA typu. Aby bylo možno vyslovit názor, že se jedná o P-ANCA, je zapotřebí provést konfirmaci na formolem-fixovaných granulocytech a na některém substrátu používaném pro detekci ANA – nejlépe opičích játrech nebo HEp-2 buňkách v ředění, při kterém jsou detekovány ANCA.

V případě podezření na akutní vaskulitidu je vhodné provádět detekci ihned na kombinaci substrátů nebo přímo vyšetřit specifitu metodou ELISA (anti-PR3, anti-MPO).

Nejsou-li k dispozici IIF techniky, je možné provést stanovení také pomocí ELISA, kde je nutné provádět současně minimálně detekci anti-PR3 a anti-MPO protilátek. Výhodné je využívat tzv. ANCA typizační ELISA panely, které dovolují detekovat a stanovovat současně 6-8 druhů ANCA protilátek. Musíme mít však stále na paměti, že pomocí ELISA nemusíme zachytit všechny ANCA protilátky, které můžeme nalézt pomocí IIF. Na druhou stranu je diagnostický význam jiných ANCA protilátek než PR3-ANCA a MPO-ANCA velmi omezený.

Tab.1: Testování ANCA metodou nepřímé imunofluorescence

EtOH-GR - granulocyty fixované etanolem

HCHO-GR - granulocyty fixované formalínem

nukl - nukleární, per - perinukleární, neg - negativní, cytopl - cytoplazmatický, sin - sinusy, hepat - hepatocyty